O setor de Micologia Clínica divide muitas opiniões no que se refere ao seu funcionamento e enquadramento dentro do setor de Microbiologia Clínica. Neste ramo de análise laboratorial, estudam-se, diagnosticam-se e pesquisam-se as doenças provocadas por fungos. Sabe-se que fungos são organismos morfologicamente e fisiologicamente diferentes de bactérias, por isso não é recomendável que estes dois setores colidam e atuem em um mesmo ambiente. O controle de biossegurança em bacteriologia é um controle rígido e em face da facilidade de contaminação de amostras e culturas por organismos fúngicos, deve-se separar as duas linhas diagnósticas em no mínimo, ambientes separados.
Além disso, muitos materiais e procedimentos que são realizados dentro de um laboratório de diagnóstico micológico não são utilizados em uma rotina voltada para a bacteriologia. Meios de cultura destinados ao crescimento de bactérias são ineficazes quando o objetivo é o crescimento fúngico, haja vista que muitos fungos possuem necessidades metabólicas específicas para que seu crescimento seja garantido. Da mesma forma que fungos podem ser considerados contaminantes em culturas bacterianas, o crescimento de colônias de bactérias em culturas fúngicas pode representar sérios erros nos processos pré-analíticos e analíticos.
Com relação aos meios de cultura utilizados em cada setor, têm-se um perfil muito diferente em suas composições e princípios. A composição dos meios de cultura em micologia baseia-se na disponibilidade de nutrientes essenciais para o crescimento de espécies fúngicas, principalmente aquelas fastigiosas. Semear amostras biológicas para a pesquisa fúngica é um trabalho que requer muita proficiência do micologista, pois é sua função avaliar e definir as melhores metodologias para guiar o processo analítico até a identificação do agente etiológico da infecção pesquisada.
Nesta matéria, serão discutidas algumas das principais técnicas de semeio e cultura utilizados em um laboratório de diagnóstico micológico.
1 – Semeio e cultura em Tubo
O semeio de amostras micológicas geralmente é realizado em tubos no laboratório de miologia. Esse tipo de frasco é utilizado por ter diversas vantagens para esse tipo de cultura. Como na pesquisa de fungos não há objetivo em separar pequenas colônias mas sim o fungo como uma colônia única, esse tipo de recipiente favorece o crescimento do microrganismo bem como o meio de cultura utilizado promove uma boa disponibilidade de nutrientes.
O meio de cultura mais utilizado na rotina de micologia é o Ágar Sabourand, que é composto por nutrientes essenciais baseados em alguns carboidratos e proteínas. Em alguns casos, pode vir acrescido de um forte antibiótico conhecido como cloranfenicol, capaz de impedir o crescimento da maioria das bactérias que possam aparecer em amostras contaminadas. É um excelente meio para o crescimento de organismos fúngicos, isolando-os de possíveis outros microrganismos contaminantes. Em tubo e placa, esse meio assume característica física sólida.
Para tubos fechados, este meio é semeado com alíquotas da amostra utilizando swabs ou alças calibradas. A amostra deve ser sempre semeada na superfície do meio, evitando sua perfuração. Após o semeio, o tubo é vedado e levado para estufa ou para crescimento à temperatura ambiente, abrigado da luz e da umidade.
O crescimento é bastante visível após alguns dias, sendo uma boa amostra para identificação microscópica e para a realização de alguns outros testes.
2 – Cultura e Semeio em placa contendo ágar
Em placas contendo meios de cultura, várias são as formas adequadas de semear amostras fúngicas. No caso de amostras líquidas ou cremosas, pode-se optar pelo semeio em estrias, porém este tipo de técnica não é recomendado para todos os casos. A técnica mais adequada para o semeio de amostras fúngicas, sejam elas sólidas, cremosas ou repiques, consiste em realizar a inoculação da amostra em sete pontos equidistantes da placa de meio, garantindo assim uma distância ideal entre as colônias que virão a crescer e uma maior chance de isolar o microrganismo patogênico pesquisado.
O tipo de meio de cultura utilizado influencia muito no critério de análise a ser utilizado na rotina laboratorial. No caso de pesquisa de Candida spp. é recomendável a utilização de meios cromogênicos, seletivos e diferenciais, capazes de facilitar a identificação das espécies de Candida presentes na amostra. Neste tipo de meio, cada espécie do fungo que cresce no meio, adquire uma coloração diferente, que pode ajudar na identificação final do agente etiológico. O meio de cultura mais conhecido por esse princípio denomina-se de Meio Cromo-Ágar-Candida.
Repiques também podem ser realizados seguindo critérios de cultura e isolamento em placas de ágar. Após este processo, pode-se seguir com testes de identificação molecular ou bioquímica, além de um procedimento de identificação estrutural conhecido como Microcultivo em lâmina.
3 – Microcultivo em lâmina
Esta técnica é realizada após o isolamento da colônia fúngica pesquisada e tem o objetivo de identificar o fungo a nível de espécie através de suas estruturas de brotamento, como conídeos, esporos e hifas. Toda essa estruturação morfológica pode diferenciar cada espécie de fungo que comumente causam doenças em seres humanos.
O procedimento consiste em cultivas pedaços da colônia isolada em uma placa contendo no centro uma lâmina, sob ela um pedaço de meio de cultura e uma lamínula logo acima. O fungo é inoculado de forma à crescer na lamínula que posteriormente será utilizada para a confecção de uma lâmina de microscopia onde serão identificadas estruturas de brotamento fúngico.
Após essa visualização microscópica, utilizam-se chaves de identificação taxonômica para determinar gênero e espécie fúngica para emissão do laudo. Características epidemiológicas costumam influenciar neste processo e guiar o analista para uma melhor resolução do caso clínico.
O diagnóstico micológico é um processo complexo, que precisa ser guiado por um profissional capacitado e experiente em relação à micologia. O uso de bons meios de cultura e o uso de procedimentos operacionais padrão (POP’s) pode auxiliar na garantia da qualidade dos resultados obtidos. Conhecer as principais técnicas de cultura e semeio é o primeiro passo para a oorganização de uma rotina diagnóstica completa de um laboratório micológico.
Por Denilson de Araújo e Silva
Graduando em Biomedicina pelo Centro Universitário UNINOVAFAPI
Pós-Graduando em Microbiologia Clínica pelo Instituto GPI
